Práctica 5. elaboración de un Frotis.

El alumno de laboratorio clínico debe realizar un trabajo de investigación muy sencillo en materia de frotis el cual después de su investigación bibliográfica debe realizar su forma practica.
Materiales

Cajas petri con medio de cultivo y microorganismos en desarrollo

Asa bacteriológica o asa de platino3

Mechero de bunsen

Vaso de precipitado (50 ml)

25 ml de agua destilada

porta objetos

Desarrollo

Con el asa bacteriológica se va a realizar un frotis en un porta objetos de cristal
Se toma el asa bacteriológica y se pone en la flama del mechero dejándola al rojo vivo para que se esterilice se retira del fuego, se toma una pequeña gota de agua destilada, con ella misma se extrae una pequeña muestra del material bacteriológico que creció en las cajas petri.
Una vez teniendo este material en el asa se deposita en el porta objetos desplazando de izquierda a derecha el material bacteriológico hasta que nos quede fino y delgado. Una vez teniéndo el frotis se fija de forma directa en sus partes laterales a lo largo para su transporte, se toma el porta objetos de forma lateral para poder pasar por encima de la flama (nunca se debe dejar en forma directa) en la flama. Una vez fijado el frotis, queda listo para el proceso de tinción.

Práctica 3. Observación microscópica de colonias bacteriológicas

El alumno debe realizar la observación microscópica en el medio de cultivo sembrado.

Materiales.

5-7cajas petri con medio de cultivo

herramienta de medición Vernier o pie de Rey

Torundas de algodón seco

Torundas de algodón alcolisadas

2 Mecheros de bunsen

Desarrollo.

Registrar la observación , medición y conteo de las colonias bacterianas. esto se debe verificar en un campo de esterilización que s e realiza con los dos mecheros bunsen, donde verificaremos el olor, color y dimensión de colonia.

Práctica 3. Siembra por Estrias

El alumno debe realizar una siembra en medio de cultivo de forma estriada, y aplicando el nombre de cada una de ellas.

Materiales:

Asa bacteriológica o Asa de platino

Vaso de precipitado con Agua destilada

2Mecheros de bunsen

5-7Cajas petri con medio de cultivo

papeles para cubrir mesa de laboratorio

Maskin tape

jeringa desechable (5ml)

torniquete

torundas alcolizadas

tubos de ensaye tapón rojo

centrifuga

tubo cónico

porta objetos

verduras para preparar tortas

Toma de muestra-sangre fresca 2.5 ml

muestra de Orina

Muestra interdental (saliva)

Agua preparada en la calle (horchata, Jamaica)5

Desarrollo.

Se realiza el proceso de acepcia y antisepcia del pliegue del brazo utilizando una torunda con alcohol. una vez hecha la acepcia inicia la tecnica de venopunción utilizando la jeringa desechable.

se aplica el torniquete en la parte media del brazo para hacer presión y obtener una basodilatación del conducto sanguíneo, en el cual se introducirá la aguja. ya estando esta dentro del bazo sanguíneo extraemos la sangre en cantidad de volumen de 2.5 ml, la que depositaremos en el tubo con tapón rojo sin anticoagulante.

no se retira el tapón del tibo, se introduce la aguja en él teniendo un vaciado rápido en su interior. se retira la jeringa con aguja y una vez tomado éste tiempo desde su extracción hasta el llenado del tubo registraremos lo que llamaremos tiempo de coagulación, que es de 1 a 5 min, y hasta 8 min.

una vez separado el paquete sanguíneo del plasma , en el tubo de ensaye vacío trasvasamos el plasma, que es color amarillo pálido, el cual utilizaremos para la siembra.

NOTA: esta técnica se utilizará nuevamente en la práctica 8.

Se sembrará el liquido plasmático en el medio de cultivo utilizando la técnica con una varilla de cristal lamada siembra poir dispersión.

Práctica 2. Técnica de esterilización (Autoclave)

Técnica de Esterilización en el Auto Clave (calor húmedo)

El alumno debe realizar el proceso de esterilización del preoducto que ocupará en la práctica de siembras, para ello requiere tener los conocimientos de la técnica de esterilización en autoclave ya anteriormente dada.

Materiales:

Autoclave

Agua destilada

Se esterilizará el producto a 15 libras de presión y una temperatura de 120° centígrados durante 20 minutos.Una vez terminada la esterilización se deja enfriar el producto, se libera del Autoclave se entrega en las mesas y se llevara acabo el baseado en las cajas petri.
Para el baseado en cajas petri se requiere de un campo de esterilización en la mesa con 2 mecheros para que el producto, se libere del autoclave se entrega en las mesas y se llevara acabo el baseado en las cajas petri.

NOTA: Vitácora de trabajo

El alumno debe realizar su propia vitácora de trabajo en la cual registrará nombre de la práctica, tiempos utilizados, fecha de elaboración y observaciones.

en esta vitácora debe ir al final un recuadro que indique un espacio para firmar de aceptado o rechazado; esta debe ser cuadriculada utilizando creatividad.

Práctica #1, Medios de Cultivo

MEDIO DE CULTIVO

Objetivo (realizar por el alumno)
Introducción

Índice

Indicaciones para desarrolllar un medio de cultivo:

1. Disponer de equipo de Bioseguridad para realizar trabajo de Laboratorio (5 minutos)
2. Solicitar un formato para anotar los materiales de Laboratorio que se van a utilizar.

3. Vestir mesa de Laboratorio con papel blanco.

4. una persona deberá verificar que esté activada la línea de gas LP. para ello se deben conectar los mecheros y abrir las válvulas que se encuentran bajo la mesa de trabajo. una vez verificado el gas, se habilita el equipo de esterilización llamado Autoclave, al cual se leintroducirá agua destilada para llevar a cabo la esterilización con calor húmedo.

Materiales para medio de cultivo:
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Probeta graduada 250 ml
Vaso de Precipitado 250m
Vidrio de reloj
Varilla de cristal o Agitador
Espátula
Balanza granataría
Torundas secas

seis cajas petri

2 mecheros de Bunsen

Desarrollo.

Pesar el polvo del medio de cultivo utilizando el vidrio de reloj. Solicitar al Laboratorio agua destilada dependiendo la cantidad de producto que se valla a agregar, el producto que vallamos a ocupar de cajas petri siendo un total de 7 cajas petri por mesa.
Una vez pesado el polvo de medio de cultivo se mezcla en el contenido de agua que se tiene en el vaso de precipitado. Para poder mezclar que no queden grumos se utiliza una varilla de cristal para agitar hasta que se disuelva el polvo en el agua completamente.
Una vez que ya tenemos la mezcla dejamos reposar el producto.

Después del reposo del producto se le da movimientos con un movimiento de muñequeo exponiéndolo al fuego de mechero, estos movimientos y exposición darán como resultados una ebullición y se le dará desde momento que inicia la ebullición 1 minuto de tiempo.

Se debe tener cuidado con la ebullición del producto en el matraz Erlenmeyer ya que este puede ocasionar quemaduras hasta de segundo grado. Una vez terminado el proceso de ebullición del medio de cultivo se deja enfriar, se tamponea con torundas de algodón se cubre con cinta maskin tape. se etiqueta con registros del medio de cultivo, numero de mesa y la fecha de elaboración y hora para introducirse al autoclave.
Aplicar tecnica de esterilización.

ya esterilizado el medio dse cultivo se retira del autoclave, se deja enfriar poniendolo dentro del campo de esterilización de la mesa, y se preparan los materiales para realizar el vaciado delñ producto.

para realizar el vaciado en las cajas petri se toma el matraz erlenmeyer, se esteriliza la boquilla del mismo a fuego del mechero, pasando lentamente, y una vez listo se vierte el liquido del medio de cultivo que se depositará en cada caja petri.

ya estando las cajas petri trasvasadas se dejan semitapadas para evitar que haya vapor en su interior.

ya solidificado el líquido, se tapan las cajas petri, y ya cerradas se estiban, se etiquetan con los datos del medio de cultivo(nombre, mesa, fecha de elaboración...) y se entragan al encargado del laboratorio.

Etapas de los análisis clínicos.

1. Etapa pre-analítica.

Proceso que empieza en la solicitud que el cliente formula, facilitándole la información y asesoramiento necesario para conectar la mas aducuada respuesta a sus necesidades. ´roceso desde la recepción de la muestra en el laboratorio hasta otorgarse la información al cliente de interés.

2. Etapa analítica.

Se procede a la recepción y distribución a cada sección del laboratorio, iniciándose el análisis de la muestra segun la metodología mas conveniente para cada caso.

3. Etapa post-analítica.

Se exponen los resultados obtenidos del análisis de la muestra.

Salmonella Typhi. Brucella Abortus

A) Salmonella Typhi

Salmonella enterica subgrupo enterica serotipo Typhimuriun (también llamada Salmonella typhimurium por simplificación). El nombre enterica está asociado a las estructuras intestinales.
Esta bacteria se encuentra a menudo en pollos y sus huevos y en reptiles como las tortugas, por eso no es recomendable mantener a estos animales como mascotas.
La salmonella es un bacilo gramnegativo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Se ha sabido, recientemente, que la causa más común del envenenamiento de comida por especies de Salmonella es debido a la S. Typhimurium. Como su nombre sugiere, esta bacteria causa enfermedades parecidas a la fiebre tifoidea en ratones.
En humanos, S. typhimurium no causa una enfermedad tan severa como la S. typhi (otra variación de Salmonella que causa la fiebre tifoidea) y normalmente no es fatal). La enfermedad se caracteriza por causar diarreas, dolores abdominales, vómitos y náuseas, y, generalmente, dura aproximadamente siete días.
Desafortunadamente, en personas cuyo sistema inmune este comprometido, como es el caso de las personas de edad, jóvenes, o personas con el sistema inmune deprimido, la infección por la Salmonella termina siendo fatal si es que no es tratada a tiempo con antibióticos.

Enfermedad. Fiebre Tifoidea

La fiebre tifoidea o fiebre entérica es una enfermedad infecciosa producida por Salmonella typhi (bacilo de Eberth), o Salmonella paratyphi A, B o C. Su reservorio es el hombre, y el mecanismo de contagio es fecal-oral, a través de agua y de alimentos contaminados con deyecciones.
El bacilo ingresa por vía digestiva y llega al intestino, pasando finalmente a la sangre, causando una fase de bacteremia hacia la primera semana de la enfermedad; posteriormente se localiza en diversos órganos y produce fenómenos inflamatorios y necróticos, debidos a la liberación de endotoxinas. Finalmente, las salmonelas se eliminan al exterior por las heces.
En el período de incubación, que dura de 10 a 15 días, se aprecian trastornos del estado general, una fase de bacteriemia con fiebre que aumenta progresivamente hasta alcanzar 39-40 ºC, en cuyo momento se mantiene, cefalea, estupor, roséola en el vientre, tumefacción de la mucosa nasal, lengua tostada, úlceras en el paladar y, a veces, hepatoesplenomegalia y diarrea.
La enfermedad puede evolucionar a la curación en 2 semanas o prolongarse con localizaciones focales a partir de la quinta semana. Si no se somete a un tratamiento adecuado pueden presentarse complicaciones graves, como hemorragia y perforación intestinal, shock séptico. Se produce un cierto grado de inmunidad que, aunque no protege frente a las reinfecciones, cuando éstas se producen son más benignas. El estado de portador puede ser transitorio o crónico.

B) Brucella Abortus

La brucelosis, también conocida como fiebre de Malta, es una enfermedad infecciosa que se presenta con episodios recurrentes de fiebre, debilidad, sudoración y dolores vagos. Es provocada por una bacteria llamada Brucella abortus, que está en la sangre, las secreciones y la leche de vacas, cerdos, ovejas y cabras.

El período de incubación de la brucelosis, esto es el tiempo en que no se presentan todavía los síntomas, se establece entre entre 5 días y varios meses (con un promedio de 2 semanas). Los síntomas y signos más típicos son: fiebre y escalofríos, con elevación de la fiebre por las tardes; dolores muy intensos de cabeza; dolores musculares y articulares; estreñimiento; pérdida del apetito; pérdida de peso y debilidad. También se registra un aumento de tamaño del bazo, el hígado y los ganglios linfáticos.

Medios de Cultivo

a)Concepto.
Solución que cuenta con los nutrientes necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones favorables de temperatura y pH), así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido.

b)Clasificación.
Según su aspecto físico:
fosiferoliquidos
Semi-sólidos
Sólidos duros o muy duros
Según su uso:
Selectivos
Selectivos de enriquecimiento
Diferenciales
Para cultivar gérmenes anaerobios
Para medir potencia de antibióticos
De transporte en micro
Para filtración a través de membrana
Para cultivo de hongos y levaduras
Para cultivo de protozoarios

c)Tipos de Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.

• Cultivo en medio líquido
  Cultivo en medio sólido
• Puede ser en tubos o placas.
• En superficie
• Incorporada

Paramesium(Grupo Ciliado)

Salmonella

Es un género de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula ni esporas. Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa.
Es un agente zoonótico de distribución universal. Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, en el procesado de alimentos o en el hogar, también por vía sexual.
Algunas salmonellas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo cual puede ser importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y alimentos.

Escherichia coli

Quizás el organismo procarionte más estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales y por ende en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor. Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Además produce vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaeróbico facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología molecular.

Proteus
Es un genero de bacterias gramnegativas, que incluye patógenos responsables de muchas infecciones del tracto urinario. Las especies de Proteus normalmente no fermentan lactosa por razón de tener una β galactosidasa, pero algunas se han mostrado capaces de hacerlo en el test TSI (Triple Sugar Iron). Son oxidasa-negativas y ureasa-positivas. Algunas especies son mótiles. Tienden a ser organismos pleomórficos, no esporulados ni capsulados y son productoras de fenilalanina desaminasa. Con la excepción de P. mirabilis, todos los Proteus reaccionan negativos con la prueba del indol.

Brucella
es un género de bacterias Gram negativas. Son cocobacilos pequeños (0,5-0,7 por 0.6-1.5 µm), no-móviles y encapsulados. Se conocen unas pocas especies de Brucella, cada una de las cuales se diferencia ligeramente en la especificidad del huésped: B. melitensis infecta cabras y ovejas, B. abortus infecta vacas, B. suis infecta cerdos, B. ovis infecta ovejas y B. neotomae. Recientemente se ha descubierto una nueva especie en mamíferos marinos: B. pinnipediae.Brucella es la causa de la brucelosis, una verdadera enfermedad zoonótica (no se ha descrito la transmisión humano-a-humano). Es transmitida por la ingestión de comida infectada, contacto directo con un animal infectado o por inhalación de aerosoles. La exposición infecciosa mínima está en 10-100 organismos. La brucelosis se produce principalmente por exposición ocupacional (por ejemplo, exposición al ganado, ovejas, cerdos), pero también por el consumo de productos lácteos no pasteurizados.